发表期刊:Front Cell Dev Biol
影响因子:5.201
应用技术:scRNA-seq、WISH、IHC
眼前节(AS)的组装是脊椎动物视觉系统发育过程中的关键事件。此过程失败会导致眼前节发育不全 (ASD),ASD会引起包括角膜混浊,虹膜发育不全,青少年青光眼,以及包括彼得氏异常症和阿克森费尔德-里格尔综合症在内的多种疾病单独或组合出现。
眼前节主要由神经嵴细胞 (NCC) 衍生的眼间质 (POM) 促进其发育形成,研究发现有几种基因与POM或ASD相关,先前研究发现在ASD患者中最常见的突变涉及转录因子是pitx2以及foxc1;lmx1b与指甲-髌骨综合症和青光眼易感性有关,Lmx1b在小鼠角膜虹膜角中正在发育的角膜,虹膜,睫状体和小梁网中表达,并且对于斑马鱼中的POM迁移至关重要。尽管有研究揭示了与POM或ASD相关的一些基因,但迄今少有研究揭示POM细胞如何迁移并参与AS形成,并且调控POM正常表达,迁移和分化的机制仍然未知。
综上,该研究旨在描述促进AS形成的发育学基础。使用斑马鱼胚胎来表征AS相关的POM细胞 (ASM) 精确迁移模式和转录图谱。对AS早期发育阶段ASM的分布,迁徙动态和人口规模进行了分类。利用单细胞转录组学,比较显示了四个特定的细胞聚类,每个聚类都与潜在的新型AS调控基因相关。该研究发现,AS相关的POM细胞由几个亚种群组成,每个亚种群都可以通过其自身的分布、迁移模式和基因表达谱来识别。
1、WISH 显示POM相关基因独特的表达模式,共表达分析证明POM的异质性
利用整体原位杂交技术(WISH),使用年龄在12,18,24,32,48,和72 hpf的胚胎来揭示POM相关基因foxc1a,foxc1b,EYA2,FOXD3,PITX2,SOX10,lmx1b.1和2同时在原始神经嵴流内和AS周围的表达模式。观察到在早期AS形成过程中,POM相关基因在并非统一共表达,而是呈现各自独特的表达模式(图1)。因此基于WISH观察,假设AS定殖的POM种群可能是异质的。
随后,在32和48 hpf下进行了两色荧光整体原位杂交(FWISH),确定POM相关基因foxc1,foxd3,sox10和pitx2之间共表达的程度。在32 hpf,AS相关的POM尚未显示出与POM相关调控基因的同质表达模式(图2)。这表明在AS定殖前POM已经是异质的种群,而不是AS定殖之后开始多样化。
图1已知POM和神经嵴相关标记基因的整体原位杂交(WISH)图
图2 两色荧光原位杂交(FWISH)支持ASM异质性
2、IHC和3D、4D成像说明ASM亚群各自不同的靶向和迁移模式
利用已知的可标记POM转基因品系:Tg [ foxc1b:GFP],Tg [ pitx2:GFP],Tg [ lmx1b.1:GFP]或NCC转基因品系:Tg [ foxd3:GFP ],Tg[sox10:GFP]。将转基因胚胎固定在关键的AS发育阶段(24、26、28、30、48、56和72hpf),并使用免疫组化IHC)检测GFP。研究观察到了AS定殖的有序模式,foxc1b,foxd3,sox10,pitx2和lmx1b.1均有各自的靶向模式(图3)。
使用体内4D成像跟踪了ASM细胞在AS中的迁移。记录了foxc1b,foxd3,pitx2,lmx1b.1和sox10的迁移。数据表明,所有转基因品系中ASM细胞均以随机方式迁移,与颅内NCC相似,ASM细胞缺乏前导/跟随细胞身份或链迁移行为。分析跟踪细胞的总行进距离,最后通过检查AS中单个细胞的位移来测量定向迁移的程度,数据表明所有ASM细胞都高度迁移(图4)。综上,ASM表现出的迁移模式和行为进一步支持了在AS定殖期间ASM是异质种群的假设。
图3 眼周间质亚群分布分析。(A)包含24至72 hpf的POM转基因品系中包含AS的共聚焦堆栈的3D渲染(B)在24、30和48 hpf的每个AS象限(DN,DT,VN和VT)内量化的GFP +细胞分布(C)在24、30和48 hpf下的POM定殖模型(D)每个转基因品系在24–72 hpf的平均AS细胞种群大小
图4 POM于眼前节定殖的体内4D成像
3、ASM的scRNA聚类分析和新发现的AS标记
单细胞测序后,通过K均值聚类(t-SNE)得到了四个不同的聚类(图5A)。鉴定出一个主要为NCC样的聚类(聚类1),其细胞主要来源于foxd3和sox10转基因株系(图5B)。在聚类2中发现了foxc1b占绝大部分-70.1%,Pitx2主要在聚类3中发现,占83.9%,在其他聚类中发现的比例低。Lmx1b衍生细胞在所有4个聚类中几乎平均地表达(图5B)。UMAP图中聚类的位置可预测sox10 / foxd3与pitx2,pitx2和lmx1b / foxc1b,以及lmx1b / foxc1b与foxc1b衍生细胞之间的联系(图5C)。综上,没有一个聚类仅由源自一个单独的转基因系的细胞组成,ASM细胞的四个不同聚类亚群进一步证明ASM的异质性。
基于与ASD相关疾病的关联或与POM / NCC样表达模式的潜在相似性(图5D),分析了几种潜在的与AS正常发育有关基因的表达,评估它们在48和72 hpf对AS发育的贡献。分析的基因包括sparc(聚类1);gng13b,hmgn2和adcyap1b(聚类2);cyt1,arg1,ponzr3和si:ch211-195b11.3(聚类3); 和lum,fmoda,tgfbi和col2a1a(聚类4)。其中,发现一些与早期AS形成相关的几种新标记基因:sparc与发育中的AS晶状体和虹膜区域的外围相关;72hpf时观察到hmgn2的在整个AS区域,adcyap1b在晶状体边缘和未来的虹膜区域的高表达;cyt1和AGR1标记了在眼周和AS区域的真皮细胞;到72 hpf时, fmoda在AS中有强表达,tgfbi和col2a1a有一些重叠表达(图6),这些标记可能是AS发育和/或AS功能的未表征调节基因。
图5 48 hpf的眼前节间质ASM单细胞聚类分析
图6 测序基因的基因表达。(A)Sparc的代表表达聚类1(B)gng13b,HMGN2,和adcyap1b表达代表聚类2(C)cyt1,arg1和ponzr3表达代表聚类3(D)lum,fmoda,col2a1a,和tgfbi表达代表聚类4。黄色箭头指示AS表达,红色箭头指示眼周表达
该文章研究结果表明靶向眼前节(AS)的POM细胞(称为ASM)不是同质的,而是同时包含沿ASM分化途径划分的几个亚群,scRNA聚类还显示了与AS发育和/或功能潜在相关的几个新标记基因,包括lum,fmoda,adcyap1b,tgfbi和hmng2。我们的发现为AS发育和ASD疾病领域开辟了许多可能的新研究途径,以进一步了解眼睛的发育以及最终易患ASD疾病的机制和原因。