大师姐答疑 | CRISPR screen | 自己也能做CRISPR高通量筛选
实验室里都是one by one研究某一通路的师兄师姐，顶多做个384孔板，就算高通量了。我的课题需要从全基因组范围寻找线索，需要做高通量实验，好想要一位做高通量实验的师姐，带我入门，带我玩耍 ~ ~ ~
嘉因生物《高通量实验大师姐答疑活动》
**期提问：我需要一位擅长高通量实验的大师姐 | ChIP实验问题请留言
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第二期——CRISPR screen实验答疑
想用高通量实验解决自己感兴趣的科学问题，技术瓶颈如何克服？嘉因生物为您一站式解决，CRISPR screen、ChIP-seq、ATAC-seq、Hi-C、RNA-seq，从实验、测序、到多种数据整合分析。送到家门口的CRISPR screen10月份开培训班。为取得更好的培训效果，小丫征询了大家的问题，做CRISPR screen的大师姐来解答啦！
括号（）里的是小丫碎碎念
Q1：CRISPR screen是啥？跟CRISPR/Cas9有啥区别？
A：CRISPR screen是基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，对多个基因或全基因组的基因功能进行同时研究的一种方法。
而通常我们说到CRISPR/Cas9，是指运用CRISPR/Cas9基因编辑技术对单个基因的功能进行研究。两者的区别主要在于单个基因还是多个基因功能进行研究。
（前者高通量，后者低通量；量变积累成质变，二者解决的问题不在同一level）
Q2：什么人对CRISPR screen感兴趣？
A：做基础研究的科研人员如高校、科研院所的研究人员可以运用 CRISPR screen技术对多个基因功能同时进行研究，来解决一些科学问题，诸如疾病治疗过程中药物作用靶点的研究、基因相互作用研究（联合致死）、基因调控研究、药物耐药相关基因研究；
临床科研人员同样可以运用CRISPR screen技术筛选疾病治疗靶点，如目前治疗靶点不明确的一些肿瘤；
此外，工业客户如大型制药公司的研发部门也可运用此项技术来寻找新的治疗靶点，进一步开发成药。
（掌握CRISPR screen，找工作又多了一条选项）
Q3：目前用CRISPR screen发表的文章怎么样？
A：目前CRISPR screen发表的文章主要有算法开发、数据分析及技术应用几方面。从2014年**篇CRISPR screen文章到目前为止（2017.8.10）一共发表了200多篇CRISPR screen相关文章，其中影响因子10分以上的有53篇，其中2篇文章的**单位为国内研究团队：Nat Biotechnol. 2016 Dec;34(12):1279-1286；Nat Methods. 2016 Dec;13(12):1029-1035。（其中一篇是国际合作的，对不？）
（目前方法学的文章居多，把应用搞起来，又将掀起一个研究浪潮；就像当初二代测序推动了表观遗传学的发展一样，CRISPR screen又将推动哪个领域的发展？您想赶在波峰前发paper？还是波峰后？）
Q4：用CRISPR screen研究耐药问题，实验设计中需要考虑哪些问题？
A：运用CRISPR screen研究耐药问题时，主要需要考虑以下几个问题：
一、药效是否能够通过细胞或动物模型来定量评价；
二、检测指标是否容易检测（如肿瘤细胞的存活或死亡，这个就比较好量化）；
三、在什么样的细胞模型或动物模型上来做；
四、运用什么样的文库进行筛选；
五、所选的细胞是否易于被病毒感染；
六、细胞生长的速度快慢等等；
七、注意设置对照组。
Q5：CRISPR screen的技术难点在哪里？
A：CRISPR screen的技术难点大概可以概括为以下几个方面：
一、文库中sgRNA的有效性和特异性是最为重要的。尽量选择有效性高、特异性强的sgRNA文库来进行筛选。如果条件允许的话，尽量选择成熟的商品化的文库，时效更高。
二、文库病毒的包被也很关键。病毒滴度的高低直接影响后期的实验。高质量的文库病毒必须保证所有的sgRNA均能进入被感染的细胞，且具有一定的覆盖度。
三、细胞的培养周期也很关键。什么时候收集的细胞直接决定了后期筛选基因的真假性。
四、细胞基因组DNA的提取。经过前期长时间细胞培养，最后我们需要的是细胞基因组DNA，因此DNA的质量是承上启下的关键。
五、测序文库的构建。几轮PCR扩增出来的产物可以最后收集用来测序，这是个经验问题，需要摸索。PCR循环太多，容易引入扩增误差；反之，循环数太少，最后胶纯化的量又太少。
六、如何通过测序数据来找到感兴趣的基因，这个问题是后期数据分析的目标，也是整个实验的最终问题，同时也恰恰是一个难点。选择什么样来程序来分析；如何对数据进行归一化处理；如何对数据进行聚类分析；如何找到筛选出的基因间的相互关系，构建调控网络图；选什么样的基因进行下一步实验的验证等等，这些都是数据分析需要解决的难题。
（六条技术难点吓到小丫了好么，还好大师姐说培训班会帮我们逐一攻克这些难点，准备闯关 ~ ）
Q6：需要提前掌握哪些实验技能，才能更好的掌握培训内容？
A：需要知道一些细胞培养的基础知识，如细胞计数、细胞生长曲线的制作、药物浓度的检测等等；分子实验技术，如PCR、胶回收等；熟悉一些基本的概念，如慢病毒的包装、MOI检测、病毒感染、细胞的荧光染色等。
Q7：打算参加完培训回来就做，需要提前准备哪些特殊仪器？
A：没有什么特殊的仪器，基本都是实验室的常规仪器，如细胞培养箱、生物安全柜、倒置显微镜、离心机、PCR仪、凝胶电泳仪、杂交炉（没有的话，可以用摇床替代）、核酸浓度测定仪、水浴锅等。如果需要自己建库的实验室，**购买E-gel和Qubit 3.0分别用来跑微量的PCR样品和测量浓度较低的核酸样本。
（Qubit处于核酸浓度测定鄙视链的***，是个性价比超高的小东西：Qubit鄙视NanoDrop，NanoDrop鄙视紫外分光光度计。声明：Invitrogen没给小丫推广费）
Q8：做CRISPR screen数据分析，对电脑有哪些要求？
A：CRISPR screen数据分析对电脑要求不高，可以运行python程序，有2G 内存就足够了（性能越高，运行时间越短）。Windows 系统理论上可以，要安装很多依赖包。在Linux、苹果系统上操作这些程序比较简单。
（又给了我一个买苹果的理由。不过现在Windows系统也能装Linux了，方法详见：哈哈哈哈~哈哈！我终于有了自己的“大型机”了）
Q9：自己做CRISPR screen的成本多高？公司服务价格？
A：常规实验技术比较成熟的湿实验来做这个实验，需要摸索sgRNA文库购买、扩增、病毒包装和感染、测序文库构建等问题。不同实验室技术水平不一样，耗时不同。如果只算实验耗材和试剂成本，全基因组CRISPR screen实验（三个样本，两个重复）成本价应该在8万左右，周期大概3-4个月甚至更长（建议直接购买包装好的文库病毒）。
如果选择公司服务，实验技术成熟，节约时间，周期大概在1个月左右，目前全基因组CRISPR screen实验（三个样本两个重复）成本价12-15万左右（包括筛选实验、文库构建、测序和数据分析）。
因此，建议根据自己实验室的优势来选择不同的服务。例如自己做前期实验，后期实验（文库构建、测序和数据分析）让公司来做；或者自己做实验部分，后期数据分析的部分让公司来完成。这样不仅加快了实验的进度，还可以降低成本，保证实验的成功率。
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