Nature Genetics │IF 41.037│嘉因生物CUT&Tag和ATACseq助力核酸甲基化转录调控研究

文章结果

RNA m6A水平与DNA 5mC水平呈负相关

首先系统地分析公共数据集，作者发现在CpG岛上DNA甲基化修饰水平与m6A peak的距离成反比，提出RNA m6 A与DNA 5mC负相关，但机制不明。METTL3是m6A修饰的关键酶，因此作者检测了METTL3敲除后DNA 5mC 水平，发现，METTL3的缺失导致整体DNA 5mC水平和5mC/C比值显著增加(图1a,b)。在METTL3缺失的细胞中，野生型METTL3的外源表达可以rescue DNA 5mC 水平，但对于METTL3突变体则不能(图1b)。敲除METTL3导致整体显著降低RNA m6 A水平，更高的整体DNA 5mC水平(图1c,d）以及更多的高甲基化差异甲基化区域（DMRs）(图1d)。在RNA m6 A附近的高甲基化DMRs中的DNA 5mC水平在METTL3耗尽后，距离CpG岛 to m6 A的距离越大峰值下降(图1e)。然后，我们将差异甲基化区域定位到最近的基因上，发现超过80%的具有低m6a峰的基因也包含超DMR簇(图1g)。这表明METTL3缺失和DNA 5mC的增加与RNA m6A有关。

图1   RNA m6A修饰水平与DNA 5mC水平呈反相关性

TET1活性与全基因组RNA m6A水平相关

作者使用CUT&Tag检测了METTL3和TET1在细胞中的染色质上分布情况，综合分析显示，TET1结合与m6A水平呈正相关（图2a，b）。我们发现>为65%的TET1靶基因有m6A（图2c）。METTL3 CUT&Tag信号强度与TET1信号强度呈正相关（图2d）。大部分TET1（97.1%）与METTL3共定位（图2g），并集中于METTL3峰的中心（图2f）。METTL3敲除，表明TET1和METTL3在此过程中具有协同作用。进行了5hmC-Seal分析，发现5hmC水平显著降低，但也可以被野生型的外源表达充分逆转，而不是突变型的METTL3（图2g）。低5hmC峰主要位于超dmrs中心（图2h)和m6A峰中心（图2i)。在METTL3缺失导致的低甲基化基因中，大多数低5hmC基因具有高5mC（图2j），进一步证明了METTL3沉积的m6 A修饰在TET1介导的DNA去甲基化中共存。

图2   DNA去甲基化酶TET1的活性与全基因组RNA m6A水平相关

m6A共转录引导TET1去5mC甲基化

由于RNA m6A是共转录形成的，而TET1在转录过程中与RNA聚合酶II（Pol II）相关，作者发现82.9%的TET1结合位点被Pol II靶向（图3a），而TET1定位于Pol II的中心（图3b）。Pol II抑制剂处理的细胞显示TET1染色质结合显著减少（图3c）。METTL3缺失也会导致TET1染色质以m6 A甲基转移酶依赖的方式结合减少（图3d）。

FXR1，已经有报道是一个m6A阅读器，具有最高的基于强度的绝对量化（iBAQ）评分（图4a)。Western blot分析显示，TET1和FXR1之间存在直接的DNA和RNA支架独立的相互作用，但其他核蛋白之间没有相互作用（图4b）。与之前的报道一致，FXR1优先与m6A修饰的RNA结合，但敲除KH结构域阻碍了其结合（图4c）。大部分FXR1结合位点与m6A峰的中心一致，并位于其中心（图4d）。FXR1-DNA相互作用的位置与其RNA结合位点显著一致(图4e）。进一步分析CUT&Tag数据，显示大多数FXR1和TET1结合区域重叠（图4f），并呈正相关（图4g、h）。FXR1的缺失显著增加了DNA 5mC，降低了TET1的结合，这可以通过恢复FXR1的表达来rescue(图4i，j）。在METTL3敲除细胞中使用dPspCas13b-FXR1融合蛋白验证了这些结果，结果显示，当该蛋白与引导RNA指向定义的靶点时（图4k）时，TET1也被募集（图4l），导致DNA 5mC水平下降（图4m）。

图4   FXR1募集TET1来去DNA甲基化

m6A-5mC相互作用在转录调控中发挥作用

RNAseq结果显示，细胞中许多差异表达的RNA（709个上调，948个下调）与METTL3、TET1或FXR1减少重叠（图5a）。TET1或FXR1敲除导致METTL3敲除一样获得或失去可及性，表明METTL3、FXR1和TET1具有协同效应（图5b）。可及性的增加与基因转录量的增加显著相关，可及性的缺失与基因转录水平的减少相对应（图5c）。在高甲基化的DMRs中也发现了类似的结果(图5d）。

图5   RNA m6A的形成与DNA去甲基化结合，在染色质状态和基因转录中起作用

在人类原代组织中验证，发现ESCC的DNA甲基化水平明显低于邻近正常组织，但m6A水平明显高于邻近正常组织(图6a，b)，这与之前结果一致。大多数RNA m6A峰（64.7%）在±2000bp区域内有CpG岛，其中65.4%的m6A水平与每个峰范围内CpG岛的甲基化水平呈负相关(图6c）。在甲基化水平与m6A峰呈负相关的CpG岛中，TET1或FXR1 RNA水平与DNA甲基化水平之间的相关性更强（图6d，e）。在ESCC中鉴定了368个与RNA m6A高甲基化和DNA低甲基化相关的基因；其中，80%的基因在ESCC中的表达水平高于邻近正常组织（图6f）。基因的功能注释显示，大量存在丰富的经典癌症相关通路，如癌症中的转录失调、PI3K-AKT和TGF-β通路（图6g）。

图6   ESCC中RNA m6A形成结合DNA去甲基化对转录调控的验证

文章结论

该研究报道了 METTL3 介导的RNA 中 m6A的形成在调节DNA 甲基化和染色质可及性中起重要作用。研究发现RNA m6A 引导DNA 5mC 去甲基化，从而重新编程染色质可及性和基因转录。这一发现揭示了生物过程中 RNA 甲基化与DNA 去甲基化相结合的表观遗传调控，证明了m6A-5mC 串扰在染色质可及性和基因转录中的作用，并将这一调控过程定义为 RNA 甲基化偶联的 DNA 去甲基化。这种机制提出了基因转录的表观遗传机制的概念，对疾病状态与正常状态下的细胞转录调控提供崭新的理解。

RNA m6A 形成与 TET1 介导的 DNA 去甲基化在染色质重塑和基因转录中的工作模型